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兽用生物制品技术

更新时间:2022-08-20 10:35:40 作者:火狐体育登录链接 来源:火狐体育在线电脑版


  兽用生物制品是根据免疫学原理,利用天然或人工培养的微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质,专供相应的疫病诊断、治疗或预防之用。

  兽用生物制品种类繁多,按不同的标准分类有不同的归类。本书依据生物制品的性质、用途和制法等将其分为疫苗、类毒素、诊断制剂、免疫血清、免疫调节剂、微生态制剂。

  (1)活疫苗 又称弱毒疫苗,它是微生物自然强毒株通过物理、化学或生物处理,并经连续传代和筛选,培养而成的丧失或减弱对原宿主动物致病力,但仍保存良好免疫原性和遗传特性的毒株,或从自然界筛选的具有良好免疫原性的自然弱毒株,经培养增殖后制备的疫苗。其优点是可以在免疫动物体内繁殖;能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应;免疫力持久,有利于清除局部野毒;产量高、生产成本低。缺点:是疫苗残毒在自然界动物群体内持续传递后有毒力增强和返祖危险;有不同抗原的干扰现象;要求在低温、冷

  (2)灭活疫苗 又称死疫苗,用标准强毒或免疫原性良好的弱毒株,经人工大量培养后,用理化方法将其灭活后制成的疫苗。其优点是微生物不能在免疫动物体内繁殖,安全性好;不存在毒力返祖现象;有利于制备多价或多联等混合疫苗;制品稳定,受外界环境影响小,有利于保存运输。缺点是该类疫苗免疫剂量大,生产成本高,有时需多次免疫;有的疫苗存在过敏反应;一般只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆,故常需要用佐剂来增强其免疫效果。

  (3)单价疫苗 利用同一种微生物菌(毒)株或同一种微生物中的单一血清型菌(毒)株的增殖培养物制备的疫苗。

  (4)多价疫苗 指用同一种微生物中若干血清型菌(毒)的增殖培养物制备的疫苗。

  (5)多联疫苗 利用不同种类微生物增殖培养物,按免疫学原理和方法组合而成的疫苗。

  (6)同源疫苗 指利用同种、同型或同源微生物株制备,又应用于同种类动物免疫预防的疫苗。如猪瘟兔化弱毒疫苗。

  (7)异源疫苗 ①用不同种微生物的菌(毒)株制备的疫苗,接种动物后能使其获得对疫苗中并未含有的病原体产生抵抗力。如犬在接种麻疹疫苗后,能产生对犬瘟热的抵抗力;兔接种兔纤维瘤病毒疫苗后能使其抵抗兔黏液瘤病。②用同一种微生物中的一种型的菌(毒)株制备的疫苗,接种动物后能使其获得对异型病原的抵抗力。如接种猪型布鲁氏菌弱毒菌苗后,能使牛获得对牛型布鲁氏菌病的免疫力。

  类毒素又称脱毒素。它是指细菌生长繁殖过程中产生的外毒素,经化学药品(甲醛)处理后,成为无毒性而保留免疫原性的生物制剂。接种动物后能产生主动免疫,也可用于注射动物制备抗毒素血清。

  抗血清为含有高效价特异性抗体的动物血清(或卵黄),能用于治疗或紧急预防相应病原体所致的疾病,所以又称为被动免疫制品。通过给适当动物以反复多次注射同一种抗原物质,促使动物不断产生免疫应答,在血清中或禽卵黄中含有大量对应的特异性抗体,通过提取血清或卵黄中含有大量对应的特异性抗体,通常提取血清或卵黄制成。

  利用微生物、寄生虫及其代谢产物,或动物血液、组织制备的,专供诊断动物疫病、监测动物免疫状态及鉴定病原微生物的制品称为诊断制剂或诊断液。

  该类制剂是通过刺激动物机体,提高特异性和非特异性免疫力的免疫制品,从而使动物机体对抗原物质的特异性免疫力更强更持久。

  微生态制剂又称益生素、活菌制剂或生菌剂。是用非病原性微生物,如乳酸杆菌,醋样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或双歧杆菌等活菌制剂。

  干热灭菌是用于干热空气进行灭菌的方法,均采用电加热,可自动控温,温度调节范围在室温至400℃,温差±1℃。干热灭菌器主要分为箱式和层流隧道箱式,按GMP标准要求,必须使用双扉型箱式嵌墙构造,在操作区将消毒物品装箱,灭菌后从净化区取出。

  使用方法:灭菌开始应把排气孔敞开,以排除冷气和潮气。灭菌器升温必须缓慢均匀,不能剧增,尤其是130~160℃之间不宜突击加温。要保持被灭菌物品均匀升温。干热灭菌法所用的温度一般规定为160~170℃,时间为1~2h。灭菌结束,必须让灭菌器内温度下降到60℃以下,才能缓慢开门,否则可能引起棉花纸张起火、器皿炸裂。

  注意事项:适用于耐高温的物品以及不能使用温热方法灭菌、潮湿后容易分解或变性的物品。

  生产所用的玻璃瓶、注射器、试管、吸管、培养皿和离心管等常用干热法灭菌。玻璃瓶和各种玻璃器皿灭菌前必须完全干燥,以免破裂。装灭菌物品时要留有空隙,不宜过紧过挤。各种灭菌物品必须包扎装盒,包扎的纸张不能与干燥箱壁接触,以免烤焦。

  (1)使用方法 准备→开饱和蒸汽→夹层预热→夹层冷凝水排出→放置待灭菌物品(装锅)→锁紧气门→用抽空器排出器内空气→蒸汽输入器室→排放器室内空气→开始灭菌→维持灭菌所需时间→灭菌完毕→关闭蒸汽总阀门→夹层蒸汽排出→器室送入空气→压力线度→开启器门→取出灭菌物品→清洗器室→器门小开,器室通风→结束灭菌工作。

  (2)灭菌时间和温度 不同灭菌物品的时间和温度有不同要求。常用的培养基、培养液一般116℃ 20~40min ;玻璃器皿、用具等,一般121℃ 30min。

  安全措施:蒸汽压力灭菌器是受压容器,务必保证设备完好,安全阀、压力表、温度计灵敏准确。用前检查,定期检修,校正仪表,技术鉴定。

  灭菌物品保存期:工具、用具、器皿、工作衣帽等灭菌后保存期不超过48h;培养基、溶液等最好72h内使用,最长保存期不能超过5d。

  利用γ射线、伦琴射线或电子辐射穿透物品,杀死其中微生物的灭菌方法称为电离辐射灭菌。该方法是在常温下进行,特别适用于各种怕热物品的灭菌,最适合于大规模灭菌。目前国内外大量一次性使用的医用制品都采用辐射灭菌,各种SPF动物的饲料使用辐射灭菌后,不但其营养成分不被破坏,而且使用安全、保存期长。

  辐射灭菌的优点是:①消毒均匀彻底。②价格便宜,节约能源。③可在常温下灭菌,特别适用于热敏材料。④不破坏包装,消毒后用品可长期保存。⑤消毒的速度快,操作简便。⑥穿透力强。本方法唯一的缺点是一次性投资大,并要培训专门的技术人员管理。

  目前,根据兽药GMP要求,开始应用净化空气进入无菌室。净化空气所用的洁净技术,系将经过调温调湿和过滤的无菌空气,通过排气孔循环,使室内的空气对外保持一定的压差(正压或负压),同时室内可以保持恒温恒湿和空气洁净。洁净无菌室空调过滤系统的设备有空调机、过滤机、送回风管道等。

  温室是生物制品生产的必备设备。用于细菌或病毒繁育,一般为36~38℃,培养温度有的也有特殊要求,如培养霉菌需20~25℃。

  是用于大量培养细胞的一种设备。这种大型转瓶机都安装在自动控温的温室中,并设有高温及低温的报警装置,转瓶机通过变速箱使转瓶的转速控制在9~12r/h。实验室及小规模生产的转瓶可安放在温箱中。细胞转瓶机应符合国际GMP标准的各项要求,具有可靠性高、平稳运转、拆装方便、耐酸、耐油耐腐蚀等特点。

  可进行细菌和细胞的培养,目前各生物制品企业均采用培养罐培养细菌,生产规模可观。培养罐可自动调温、调PH值,用无级调速电动机、磁搅拌、消泡、控制氧压、自动补液、换液、自动高压灭菌、自动计算呼吸商等精密仪表,而罐体结构均为不锈钢质。这种深层培养

  法的优点是可使细菌培养有比较一致的环境,抽样时高度一致性,特别便于生物化学的分析、细胞动力学及对单位体积内细胞数目增长情况的研究,也是一个生产优质疫苗的方法。

  可用于培养悬浮生长或贴壁生长的动物细胞,可生产疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素等,用生物反应器培养动物细胞比目前用的静止培养、转瓶培养有更多的优越性。

  为有效地连续对微生物、抗体及生物制剂进行浓缩、分离,必须使用超滤器。根据不同用途、不同容量、超滤器可组成内压型、外压型和实验型。它们都是以中空纤维超滤膜组件为主体,中空纤维膜为不对称半透膜,呈毛细管状,膜的外表面和内表面存在致密层,可分别形成外压和内压。在压力作用下,原液在膜内或膜外流动。体积大于微孔的溶质截留在原液内,小于微孔的溶质则随溶剂透过膜,对微粒、胶体、细菌以及各种大分子有机物具有良好的分离作用,从而可达到物质分离、浓缩和提纯的目的。

  内压型以获得纯净的超滤液为目的,主要用于提纯、除菌。外压型以浓缩为目的,原液循环直至达到需要的浓度为止,主要用于有用物质的回收。

  按GMP标准的要求,易消毒、易清洗。新型孵化器多是高分子材料制造的,耐热、耐湿,抗酸碱及消毒药,供SPF鸡胚使用的孵化器,还具有空气过滤系统,保证进入的空气呈无菌状态。

  立式胶体磨是制造佐剂的工具之一,但由于其耐磨性较差及受电压影响大的缺点,从而影响了灭活疫苗的质量。其乳化的液珠直径在1~5μm之间。

  这是一种制备超细液-液乳化物或液-固分散物的通用设备,其主要加工部件具有极高的耐腐蚀性和良好的耐磨性,对加工乳化的油佐剂、抗原均不会产生不良影响,替代原来应用的胶体磨。乳化液珠直径仅0.25~2μm。

  用于规模化油乳剂疫苗的生产,由贮油罐、油相制备罐、水相制备罐、剪切泵、乳化罐及贮苗罐组成。

  操作步骤:先打开油相制备罐通向乳化罐的阀门,并打开贮油罐压缩空气阀门,给贮油罐加压,再打开乳化罐的无菌呼吸器的阀门,然后缓慢打开乳化罐上进油阀门。油相进入乳化罐后,启动搅拌电机,使电机缓慢搅拌。关闭贮油罐上控制压缩空气的手动球阀。打开冷却水循环的手动球阀。打开水相罐通往乳化罐的阀门,并打开水相罐压缩空气的阀门,给水相罐加压,打开乳化罐上的无菌呼吸器的手动隔膜阀,慢慢开启乳化罐上的水相进入的阀门,使流量计的指针缓慢上升。将水相输入乳化罐内。从乳化罐加样口按比例加入1%的硫柳汞溶液,硫柳汞的最终浓度为10-4.然后打开乳化罐的出料阀门同时开启乳化机,开始乳化,乳化结束,打开贮苗罐的进料阀门将乳化好的乳剂苗输入至贮苗罐中。

  冷冻真空干燥设备简称冻干机,由制冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四部分组成,包括冻干箱、冷凝器、真空泵组、制冷压缩机组、加热装置、控制装置等。

  冻干箱内设有若干层隔板,冻干的制品在隔板上,隔板内置冷冻管和加热管,分别对制品进行冷冻和加热。冷凝器又称水汽凝集器或冷阱,内装有螺旋状冷凝蛇管数组,其操作温度应低于干燥箱内制品的温度,工作温度可达-45~-60℃,其作用是捕获制品升华的水蒸气,以保证冻干过程的进行。真空泵组对系统抽真空,使冻干箱中绝对压力应保持在0.13~13.3Pa。制冷压缩机组对冻干箱中的隔板及冷凝器中的冷冻盘管降温,冻干箱中的隔板可降至-30~-40℃。常用的冷冻剂有氨、氟利昂、二氧化碳等。加热装置供制品在升华阶段时升温用,应能保证干燥箱中隔板的温度达到80~100℃,加热系统可采用电加热、辐射加热或循环油间接加热。控制装置是利用计算机输出程序控制整个工作系统正常运转。

  新型冻干机冻干箱内的板层上有液压装置,箱内可通入高压热蒸汽,能够实现箱内自动压瓶塞和在线高压消毒。

  冷冻真空干燥又称冷冻干燥,简称冻干。它是物质干燥的一种方法。是将物料或溶液在较低的温度下冻结成固态,然后在真空下将其中水分不经液态直接升华成气态而脱水的干燥过程。真空冷冻干燥在生物制品方面的应用十分广泛,干燥后的制品水分被排除了96%以上,易于长期保存。生物制品冷冻干燥的程序:冻干箱进行空箱降温→液态制品装箱→预冻→升华干燥→解析干燥→结束冻干→加塞封口。

  (1)预冻 在干燥之前,先将溶液物质在低温下冻结称为预冻。预冻是将溶液中的自由化水固化,使干燥后产品与干燥前有相同的形态,防止真空干燥时起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆变化产生。

  预冻温度必须低于产品的共熔点温度,各种产品的共熔点温度是不一样的,必须认真测得。溶液达到全部凝固冻结的温度称为凝固点或共晶点,实质上物质的凝固点也是该物质的融化点,故又称此温度为共熔点。共熔点的测定是1对白金电极和1支温度计侵入待测样品溶液中,并将电极、温度计、仪表与记录仪连接,然后将溶液冷冻到-40℃以下,直至电极达到无穷大,然后缓慢升温至电阻突然降低的温度,即为该溶液的共熔点温度。实际制定工艺曲线时,一般预冻温度要比共熔点温度低5~10℃。制品装量通常为容器容量的1/4~1/5,厚度不宜大于15mm。生物制品一般预冻时间为2~4,即可开始升华。

  (2)升华干燥阶段 也称第一阶段干燥。将冻结后的产品置于密闭的真空容器中加热,冰晶升华成水蒸气逸出,使产品脱水干燥。干燥是从外表面开始逐步向内推移,冰晶升华后残留下的空隙变成升华水蒸气的逸出通道。当全部冰晶除去时,第一阶段干燥完成。此时除去全部水分的90%左右,占总干燥时间的80%。此阶段箱内的线)解析干燥阶段 也称第二阶段干燥。在第一阶段干燥结束后,必须对产品进一步干燥以除去残余水分。该阶段产品的温度应上升到该制品最高容许温度,并在该温度一直维持到冻干结束。制品最高容许温度视制品的品种而定:病毒性制品为25℃,细菌性制品为30℃,血清和抗生素等可高达40℃。箱内必须是高线Pa以下,使解析出来的水蒸气逸出产品。第二阶段干燥后,产品内残余水分的含量不超过4%。

  (4)加塞与压盖 冻干程序结束,干燥制品进行加塞、压盖,入待检库。加塞可采用箱内加塞法和箱外加塞法两种方式。目前,几乎所有生物制品企业冻干制品都采用箱内加塞法。冻干箱配有液压或气压压塞的动力装置,在真空下或放入惰性气体下,将分装时放置在瓶口上的四叉胶塞自动压紧。该方法可从根本上防止干燥制品受空气中水分和氧气的影响。

  冻干的总时间是指预冻时间、升华时间和第二阶段干燥时间总和。一般为18~24h,有些特殊的制品需要几天时间。

  冷库可分为中、小型两类。小型只设冷藏间或活动冷库。中型冷库房,一般由主体建筑和附属建筑两部分组成。主体建筑包括冷藏库和空调间;附属建筑包括包装间、真空检验室、标准间、机房、泵房、配电房等。

  保温性能应符合生物制品贮藏保管的最基本要求:①空调间,其最高库温不能超过15℃。最低在0℃以上,一般用冷风机作冷却设备。②冷藏间,要求在-15℃以下,作制品保管。为保证库温恒定,在建筑结构上,必须在其外墙、地坪、平顶设置连续的隔热层,要有足够的厚度,以阻止冷气从室内散逸;做好保温层的防潮设施,低温库要采用电动冷库门。

  使用注意事项:①新冷库初次投产时,不应降温过快,避免结构内部结冰膨胀。当库温在4℃以上时,每天降温不得超过3℃,直至到达要求为止。②冷库在使用以后,要保持温度的稳定性,即高温库(10±5)℃;低温库(—18±3)℃。③严格防水、汽渗入构造保温层;低温库内不得做多水物品的作业。④合理使用库容,合理安排货位和堆放高度,保持库内地坪受荷均匀。

  为保证生物制品的使用效果,在运输过程中必须使用具有隔热车体及降温装置的冷藏车。这类车按性能来说可分为机器冷藏车与冰箱冷藏车。目前我国多使用后者,这种车造价低,使用维修方便。无论任何类型的冷藏车,都必须具有:①具有良好的隔热车体,减少车内与外界的热交换。②设有制冷降温装置,适应生物制品的保存条件。③设有空气循环装置,以保证车内温度的均衡。④设有温度指示,最好有自动控制仪表,以控制车内温度。

  保温箱无制冷系统,亦以软木、玻璃纤维和聚氨酯泡沫塑料为保温材料。内外层常用镀锌钢板和铝板为保护层。不能自动降温至冰点以下,而是使用时将冷冻干燥的生物制品置于箱内,并加入一定的冰块,严密加盖。箱内可维持20多小时不解冻,能维持运输途中的低温保存。目前国内兽用冷冻干燥制品的运输,多使用这种简单的保温箱。

  液氮罐是专供贮存液氮用的容器,液氮的温度可达-196℃,属超低温,因而是保存活细胞、活组织、生物制品、冷冻、微生物等理想容器。液氮罐的构造和玻璃热水瓶一样,能防止热的传导、辐射和对流。液氮罐都是双壁的,双壁之间有一夹层。夹层吧、空隙越大,真空度越高,蓄冷的时间也越长。

  新罐或使用后液氮挥发已净和清洗后待用的容器,在使用前,先加入适量液氮预冷30min左右,然后加满其余的液氮,充装后的液面应低于颈管。液氮充满后,液氮出现沸腾不止或罐的上半部结霜,证明此缸的性能已不正常。放入或提取罐内的贮存物时,要迅速浸入或离开液氮面,取出被保存物的动作要快、准、稳。

  由于生物制品都是使用病原体进行制造和检验的,如果排放到外界,会造成环境污染,引起动物疫病流行,甚至危害人类健康。

  生物制品企业生产的污水,须经无害化处理,检验合格后才能排放。通常采用高压热蒸汽灭菌法。生产和检验的污水直接排放到污水储罐中,当收集于污水储罐中的污水达到一定量时,用泵向储罐夹层中通入蒸汽,待罐内温度达到100℃,煮沸60min,关闭蒸汽阀,降温后经检测合格后排放。强毒舍生产的污水排入污水管网集中到污水池,进行高压蒸汽灭菌,经检测合格后排放到污水处理站进行二次处理。

  污水排放标准:①生化需氧量(5d、20℃)达到60mg/L,生化需氧量越高,表示水中有机污染物越多;②化学需氧量重铬酸钾法达到100mg/L,氧化剂也可用高锰酸钾;③动物检测

  采用生物发酵法进行。原则是每池装满后能自然发酵2年以上。发酵池的内外墙用水泥沙浆粉刷外,还应涂沥青防水层,防止池内污水渗漏,池外地表、地下水渗入影响发酵效果。为了便于清除,应一半设在强毒区,一半设在隔离区外,以便发酵彻底后,启盖清出粪便和残渣、垫草的腐烂物。强毒区内产生的废弃物要经高压无害化处理后移出工作区,对不宜高温处理的应使用消毒液浸泡消毒处理后,进行生物发酵。

  所有感染疫病死亡的动物以及检验耐过的动物,试验结束后须宰杀,将尸体用高压蒸汽消毒、焚尸炉焚烧或化制后,按粪便残渣处理办法进行生物发酵处理,安全可靠。

  保护剂又称稳定剂,是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。

  生物制品的冷冻真空干燥一般都加冻干保护剂,以使制品在冻干后仍保持有较高的生物学活性,而且能够延长制品保存期并提高耐热性。

  (1)营养液 可使因冻干而受损伤的细胞修复,对水分子起缓解作用,并能使冻干生物制品仍含有一定量水分;还可促进高分子物质形成骨架,使冻干制品呈多孔的海绵状,增加溶解度,常为低分子有机物,如蔗糖、山梨醇、乳糖、氨基酸和糖类等。

  (2)赋形剂 主要起骨架作用,防止低分子物质的碳化和氧化,保护活性物质不受加热的影响,使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状结构,从而使溶解度增加,常为高分子有机物,如脱脂乳、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、明胶等。

  (3)抗氧剂 可抑制冻干制品中的酶作用,增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性,如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。

  (1)保护剂种类 用不同保护剂冻干的同一种微生物,在其保存过程中存活率不同。

  (2)保护剂组分浓度 保护剂组分的浓度可直接影响冻干制品细菌或病毒的成活率,必须严格掌握。

  (3)保护剂配制方法 配置方法不同会影响保护剂的效果,例如含糖保护剂灭菌温度不宜过高,否则由于糖的炭化而影响冻干制品的物理性状和保存效果,所以均采用116℃30min灭菌或间歇灭菌;又如血清保护剂就不能用热灭菌法,必须以滤过法除菌。

  (4)保护剂酸碱度(pH) 保护剂的pH应与微生物生存时的pH值相同或相近,过高或过低都能导致微生物的死亡。

  对于冻干活疫苗而言,一种良好的冻干保护剂不仅能够在冻干过程中最大限度地提高疫苗微生物的存活率,而且需要提高其耐热性,延长保存期。

  (1)5%蔗糖脱脂乳保护剂 蔗糖5g,加脱脂乳至100ml,充分溶解后,100℃蒸汽间歇灭菌3次,每次30min;或110~116℃高压灭菌30~40min。适用于鸡新城疫、猪瘟、羊痘和狂犬病等病毒性活疫苗保护剂。

  (2)明胶蔗糖保护剂 明胶1%~2%、蔗糖5%、硫脲1%~2%。先将12%~18%明胶液、30%蔗糖液和6%~12%硫脲液加热溶解,116℃高压灭菌30~40min;或100℃3次灭菌,每次30min。适用于猪肺疫和猪丹毒等细菌性活疫苗保护剂。

  兽用生物制品生产中的灭活,是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力、致病性和毒性,但尽可能不影响其免疫原性,被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗;或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性,以避免补体对诊断试验的干扰作用。灭活的主要方法有两类,即物理学方法和化学方法。

  (1)物理学灭活 包括加热及射线照射等方法。加热灭活方法除用于血清灭活(56℃ 30min)外,很少用于疫苗生产,加热杀死微生物的方法比较粗糙,容易造成蛋白质变性,因而免疫原性受到明显影响。

  (2)化学灭活 该方法目前采用最多。用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂。

  甲醛溶液是甲醛气体的水溶液,又称。常用的甲醛溶液约含37%甲醛气体,为无色透明液体,有辛辣窒息味,对眼、鼻粘膜有强烈刺激性,较冷温度下久贮易变浑浊,形成三聚甲醛沉淀,虽加热可变清,但会降低其灭活性能,故一般商品甲醛溶液加10%~15%甲醇,以防止其聚合。

  适当浓度的甲醛可使微生物丧失增殖力或毒性,保持抗原性和免疫原性,不同类型的微生物,使用甲醛灭活的浓度不同;一般需氧菌为0.1%~0.2%、厌氧菌0.4%~0.5%、病毒多数为0.1%~0.3%。不论是杀菌或脱毒,使用甲醛或其他灭活剂,其浓度及处理时间都要根据试验结果来确定,通常以用低浓度、处理时间短而又能达到彻底灭活目的为原则,必要时在灭活后加入硫代硫酸钠,以中断其反应。

  灭活作用机理是甲醛的醛基作用于微生物蛋白质的氨基产生羟甲基胺,作用于羧基形成亚甲基二醇单酯,作用于羟基生成羟甲基甲酚,作用于巯基形成亚甲基二醇。上述反应生成的羟甲基等代替敏感的氢原子,破坏生命的基本结构,导致微生物死亡。甲醛还可与微生物核糖体中的氨基结合,使两个亚单位间形成交联联,亦可抑制微生物的蛋白质合成。

  这类灭活剂能破坏病毒的核酸芯髓,使病毒完全丧失感染力,而又不损害其蛋白衣壳,从而保留其保护性抗原。

  又名石炭酸。为无色结晶或白色熔块,有特殊气味,有毒及腐蚀性,暴露在空气中和阳光下易变红色,在碱性条件下更易促进这种变化。

  是一种碱性染料,为绿色带有金属光泽结晶或深绿色结晶状粉末,易溶于醇,能溶于氯仿。

  灭活机制主要是其阳离子与微生物蛋白质带阴电荷的羟基形成弱电性化合物,妨碍微生物的正常代谢。

  (1)灭活剂特异性 在选择灭活剂时,应考虑其特异性,即应考虑其对微生物的作用范围。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体,真菌和病毒对酚类不太敏感。

  (2)微生物种类与特性 不同种类的微生物对各类灭活剂的敏感性并不完全相同;细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的抵抗力不同;生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度亦有差别。

  (3)灭活剂浓度 灭活剂浓度越高,灭活脱毒越快,但抗原损失量亦较大。有时可以采用分次加入灭活剂进行灭活、脱毒比较缓和的方法。即将灭活溶液分数次加入,加量有小至大,ph由低而高,温度逐步提高到允许的最高温度,这样利于保护抗原的免疫原性。

  (4)灭活温度 通常情况下,灭活作用随灭活温度上升而加速。但是温度上升,细菌死亡率可成倍增加,如果温度超过40℃或更高,对微生物的抗原性将有不利影响。

  (5)灭活时间 与灭活剂浓度和作用温度密切相关。一般随着灭活剂浓度及作用温度升高,灭活时间则缩短。在生物制品生产中,应以保证制品安全和效力,采用低灭活剂剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。

  (6)酸碱度(PH) pH对细菌的灭活作用有较大影响。在微酸性时灭活速度慢,抗原性保持较好,在碱性时灭活速度快,但抗原性易受破坏。同时,PH也影响灭活剂的电离度。未电离的分子一般较易通过细菌细胞膜,灭活效果较好。

  (7)有机物的存在 被灭活的病毒或细菌液中,如果含有血清或其他有机物质,会影响灭活剂的灭活能力。因为有机物能吸附于灭活剂的表面或者与灭活剂的化学基团相结合。则明显降低灭活剂的灭活作用。

  免疫佐剂是生物制品常用的物质,单独使用时一般没有免疫原性,与抗原物质混合或同时注射使用时,能非特异性增强抗原特异性免疫应答的作用。

  免疫佐剂作用:①抗原递呈。是指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗的联合作用,有助于抗原性物质在胞内被加工,被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。②抗原寻的。 是指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。佐剂可延长抗原在组织内的贮存时间,使抗原缓慢降解和缓释。③免疫调节。是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制,可以改变特异性免疫应答的本质或强度。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。

  (1)氢氧化铝胶佐剂 又称铝胶,质优的铝胶分子细腻,胶体性良好,稳定,吸附力强,保存2年以上吸附力不变。

  油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。此类佐剂著名的有弗氏佐剂(FA),分为弗氏不完全佐剂(FIA)和弗氏完全佐剂(FCA)。弗氏佐剂可使在正常状态下没有免疫原性的物质成为免疫原,其作用机理是先作用于Th1细胞,后作用于Th2细胞,并能启动细胞免疫而发挥作用。

  (1)乳剂的概念 乳剂是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒,混悬于另一不相溶的液体中所形成的分散体系。被分散的物质称为分散相(内相),承受分散相的液体称连续相(外相),两相间的活性物质称为乳化剂。

  (2)乳化剂 商品乳化剂的种类很多,通常可根据用途依据乳化剂的HLB值(亲水亲油平衡值)进行选择。HLB值高,容易形成水包油型油乳剂;HLB值低,易形成油包水型油乳剂。

  (3)白油 制乳剂苗用的白油,为无多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。

  (4)乳剂配方与乳化方法 乳化剂、油相和水相的配合比例及乳化方法,决定了制备乳剂的性状和稳定性。一种好的乳剂疫苗应是粘度低,颗粒均匀,稳定性良好,呈乳白色。

  大量生产乳剂疫苗时,可将94%白油与6%司本-80混合后加1%~2%硬脂酸铝,灭菌后即为油相;将抗原液加4%吐温-80为水相。检验:取样于10ml的离心管中装满乳剂,3000r/min离心15min,相当于保存一年以上不破乳,如不分层,即获得稳定的W/O型乳剂苗,如分层则继续乳化直至合格为止。

  细胞因子是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质,是免疫细胞间相互作用的调节信号。细胞因子的作用特点表现为多效性、靶细胞的多样性、多源性、高效性和快速反应性。几种重要的细胞因子为白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-12、γ-干扰素。

  含有非甲基化CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸)基序的脱氧核糖核酸DNA。它在诱导机体非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型等方面发挥着重要作用。

  目前,已证明经过基因突变体外表达的霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(LT)和破伤风类毒素(TT)等没有毒性,具有很好的佐剂作用。

  应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗,具有产生全面免疫应答的效力,可长期增强特异性抗体应答。

  脂质体在宿主体内可以生物降解,本身无毒性,并且能降低抗原的毒性,无局部注射反应。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用,效果最佳。

  培养基是人工制备的供细菌生长繁殖的一种营养物质,是维持与繁殖细菌的基础。

  (2)基础种子 由中国兽医药品监察所或其委托的单位负责制备、检验、保管和供应。

  以上种子如果按菌(毒、虫)种的毒力可以分为:①强毒菌(毒、虫)种:是指具有强大致病力的菌(毒、虫)种,一般免疫原性好,常用于制造某些灭活疫苗、免疫血清以及疫苗的效力检验等。②弱毒菌(毒、虫)种:是指对动物无致病力而具有一定免疫原性的菌(毒、虫)种,主要用于制造弱毒疫苗。

  生产用种子是由基础种子扩繁制备而成,包括一级种子和二级种子。通常将基础种子划线接种于适宜琼脂平板培养基中,选取经分离培养后获得的典型菌落5~10个,混合接种于适宜琼脂斜面若干支,一般37℃培养,经纯粹检查和鉴定实验,合格后,作为一级种子。

  将合格的种子液以1%~2%的量接种于适宜的培养基,然后依不同菌苗的要求进行培养。

  上述培养获得的菌液即为半成品。半成品检验包括纯粹检验和活菌计数。如果制备灭活菌苗,菌液经纯粹检验和活菌计数检验合格后,还需用灭活剂进行灭活,灭活后需进行无菌检验。

  (6)酵母浸出液 酵母浸出液含有某些维生素与生长因子,是促进细菌生产繁殖的重要材料之一。

  根据培养基配方准确称取各种成分放于容器中,加少量水浸透原料后,补足水量,使原料溶解。也可用热水或加热进行溶解,并随时搅拌,防止外溢。

  培养基配制成后一般有沉渣或混浊,须过滤澄清使其清晰透明才可使用。可用纱布、脱脂棉或滤纸进行过滤。澄清是利用培养基中引起混浊的胶体混悬物在高温下聚集沉淀的特性,将制好的培养基置于高压锅内110℃加热30min后,放置数小时,使培养基自然冷却凝固,然后取上层澄清部分进行分装。

  细菌培养是指细菌在动物体外的人工培养基以及人工控制的环境中生长繁殖的过程。制备细菌性疫苗首先应通过细菌分离培养,获得单个细菌菌落,制备细菌菌种,然后,进行规模化细菌培养。

  (1)划线接种法 此法最为常用,即在不同培养基平面上,以多种方法划线接种细菌,使细菌生成单个菌落。根据菌落特性进行鉴别、挑选典型菌落进行纯培养,制备种子培养物。

  (2)倾注培养法 该法适用于深层条件下生长良好的细菌的分离培养。即先将营养琼脂培养基加热溶解,冷至45~50℃,加入适量细菌培养液,混匀后倾入灭菌培养皿内,制成平板。置37℃培养24~36h后,挑取典型菌落移植培养。

  细菌菌种是指有一定标准的菌体增殖培养物,简称菌种。如接种量过少,会引起生长繁殖缓慢,影响活菌数,有时甚至出现无菌生长;接种量过多,就会将过多的代谢物带入培养基内,造成有害物质的抑制生长。通常菌种接种量为1%~2%。

  最佳培养时间通常依据细菌的生长曲线而定。多数在对数繁殖后期至稳定前期间活菌数最高,生命力最强,宜于收获。

  (1)固体表面培养法 常用大扁瓶琼脂平板,经无菌检验后,无菌接入菌种液,使其均匀分布于琼脂表面,平放静置培养,收集菌苔,制成细菌悬浮液,用于制备诊断抗原或疫苗。

  (2)液体静置培养法 适于一般细菌性疫苗的生产。培养容器可用大玻璃瓶或培养罐,培养基装量为容器体积的1/2~2/3,灭菌后,冷却至37℃接入菌种,保持适宜温度静置培养。

  (3)液体深层通气培养法 适用于需氧菌的培养,可加速细菌分裂繁殖,缩短培养时间,提高细菌数量。

  (4)透析培养法 透析培养是指培养室与培养基室之间隔1层半透膜的培养方法。该系统把培养基与培养物分开为各自的循环系统,中间经透析器交换营养物。

  (1)补充营养物质 根据被培养的细菌对营养要求,在培养过程中注意补充营养物质。如适当地加葡萄糖补充碳源;适当加蛋白胨或必需氨基酸补充氮源,才能更好发挥通气培养作用,增加菌数,提高制品的质量。

  (2)控制通气量 细菌对氧的需要,在不同生长发育阶段又有所不同,各种细菌繁殖过程中需氧量亦不一样。

  (3)控制最适PH值 深层通气培养PH值变化较快,保持培养过程的最适PH值很重要。

  (4)培养温度 在培养过程中要适当调节培养温度,培养罐夹层直接用蒸汽加热往往不稳定,最好用自控调节的温水循环控制温度,以使最适培养温度上下不超过1℃。

  (5)控制污染 主要是通入的空气处理不当、搅拌轴密封不严或底盘与进出液阀门灭菌不彻底等,为此,培养罐的罐体与部件,应以不锈钢制造,垫圈用聚四氟乙烯制品,使之密封良好,易于灭菌。此外空气滤过装置,首先是将压缩出来的空气通过油水分离。不能使有气味的空气进入培养罐内,经过棉花与活性炭滤器,再经过除菌过滤,以免通气带进杂菌,造成培养液污染。同时培养过程的排气管口也应有消毒设备,以免污染环境。

  活菌计数是将待测样品精确地做一系列稀释,然后再吸取一定量的某稀释度的菌液样品,用不同的方法进行培养。经培养后,从长出的菌落数及其稀释倍数就可换算出样品的活菌数,通常用菌落形成单位(CFU)表示。

  (1)倾注平板培养法 根据标本中菌数的多少,用普通肉汤将被检标本进行10倍递进稀释。取某稀释度的菌液样品1ml加在灭菌平皿中,然后取预先加热融化且冷至45~50℃的琼脂培养基分别倾入上述平皿中,立即摇匀放平,待其充分凝固后,置37℃培养一定时间。统计平皿上长出的菌落数,乘以稀释倍数,即为每毫升标本中含有的活菌数。

  (2)平板表面散布法 按常规方法制作琼脂培养基平板,分别取不同稀释度细菌液0.1ml滴加于平板上,并使其均匀散开。

  (3)微量点板计数法 本法中培养基的制备、处理及样品的稀释与平板表面散布法相同,只是每个稀释度的接种量为0.02ml,使其自然扩散。

  其原理是菌液中含菌数多少与其混浊度成正比。取一定稀释度的菌液与标准比浊管进行比浊,能概略计算出每毫升菌液中的菌数。

  其原理是在液体培养基中按0.1%量加入1%酚红溶液,利用支原体生长过程中产酸,使得培养基的颜色由粉红变成黄色,从而确定支原体含量,以每毫升颜色变化单位计数。主要用于支原体培养物的菌数测定。

  2.毒力鉴定:将单个细菌分别接种营养肉汤,37℃培养20h,取1ml接种鸡,选择死亡最快菌株,检验合格作为菌种。

  3.菌液培养:将菌种2%比例加入营养肉汤,37℃18~20h。(时间长会产生内毒素)

  6.铝胶佐剂制备:将NaOH溶液缓慢加入Alcl3溶液中,当溶液由絮状沉淀变为均一的白色时,停止加热。

  禽胚质量对于病毒和生物制品质量极为重要。目前理想的禽胚是无特定病原体(SPF)鸡胚。据国家标准,SPF鸡胚不应含有鸡的特定的22种病原体,可适用于各种禽疫苗的生产。但由于SPF鸡饲养条件严格,价格昂贵,商品化种蛋供不应求,故常用非免疫鸡胚加以补充,这种蛋只用于灭活疫苗的生产,不能用于活疫苗生产。

  生产毒种是由基础种子扩繁制备而成。通常将基础种子经适当稀释接种于动物或鸡胚中,按规定时间和温度培养,收获含病毒组织或病毒液。经毒种鉴定合格后,直接分装或冻干,注明收获日期、代次,作为生产用毒种。

  将合格的生产用毒种经适当稀释接种于动物或鸡胚中,接种方法很多,可根据培养的病毒种类进行选择。接种后的动物或鸡胚,按各自规定时间和温度进行培养,收获含毒组织或病毒液,即为半成品。

  半成品检验包括无菌检验和病毒含量测定。如果制备灭活疫苗,经无菌检验和病毒含量测定合格后病毒液,还需用灭活剂进行灭活,灭活后需进行无菌检验。半成品必须无菌,才可以进行配苗。如不合格经无害化处理。

  将合格的半成品加入保护剂或佐剂,定量分装,制成活疫苗或灭活疫苗,轧盖、贴标、包装后入待检库。 活疫苗通常加入5%蔗糖牛奶保护剂,经冷冻真空干燥制成,低温冷冻保存。灭活疫苗常用油乳佐剂,按比例与灭活毒液混匀乳化后直接分装,低温保存。

  选择动物的标准:对相应病毒有易感性高;健康,体重、年龄要基本一致,个体差别不宜过大;大动物应来源于非疫区,未接种过相应病毒疫苗的青壮年动物。

  动物接种后应每天观察特征性变化,如体温曲线、特征性临床症状等。根据观察选出接种后出现符合所要求的反应症候的动物,按规定的时间,规定的方法剖杀,采取含毒组织或器官,各项检验合格后即可使用。

  (1)绒毛尿囊膜接种 多用于嗜皮肤性病毒的增殖,如痘病毒、疱疹病毒等。选择10~12日龄鸡胚,划出气室,将卵气室向上直立,经消毒后于气室中央打孔,用细针头插入刺破壳膜,再退出气室内接种0.2ml病毒液,将病毒滴在气室的壳膜上,病毒即慢慢渗到气室下面的绒尿膜上,封口后将鸡胚直立培养。另一种方法需作人工气室法,照检后划出气室和胚位,将卵横卧于蛋架上,胚胎位置向上,消毒后于气室部位和胚位的卵壳上分别钻一个小孔,用吸耳球紧贴气室孔轻吸,鸡胚面小孔处的绒毛膜下陷形成一个人工气室,天然气室消失。在人工气室处接种0.1~0.2ml病毒液,封孔,人工气室向上横卧培养。

  (2)尿囊腔接种 通常选9~11日龄鸡胚,在气室边界上2~3mm处避开血管处,消毒后打孔,接种病毒0.1~0.2ml,封口后孵育。

  (3)卵黄囊接种法 通常用5~8日龄鸡胚,经照检后划出气室和胎位,在气室中心壳上钻一小孔,接种的针头沿胚的纵轴插入约3cm,注入0.1~0.2ml

  (1)绒毛尿囊膜的收获 将整个蛋内容物倒掉,用灭菌镊子撕下整个绒毛尿囊膜,放灭菌容器中备用。经研磨制成病毒悬液。病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的痘斑。

  (2)尿囊液的收获 用镊子压住胚体,用灭菌吸管插入尿囊液腔,吸取尿囊液。

  (3)羊水的收获 收获尿囊液后,用无菌镊子夹起羊膜,用灭菌吸管或注射器刺入羊膜腔吸取羊水。

  (5)胚胎的收获 用眼科镊子撕破绒毛尿囊膜和羊膜,挑起鸡胚,置灭菌容器中。

  毒力或毒价单位基本上采用半数致死量(LD50)表示,而且LD50的计算应用了统计学方法,减少了个体差异的影响,因此结果比较正确。以感染发病作为指标的可用半数感染量(ID50);以体温反应作指标者,可用半数反应量(RD50)。用鸡胚测定时,可用鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50);在细胞培养上测定时,可用细胞半数感染量(TCID50).

  距离比=(高于50%的死亡率—50%)/(高于50%的死亡率—低于50%的死亡率)

  (1)种蛋质量 种蛋质量直接与增殖病毒的质和量相关。最理想的禽胚是SPF种蛋,其次是非免疫种蛋。

  ①病原微生物 家禽有很多疫病及病原可垂直传递于鸡胚,如白血病等。这些病原体既可污染制品本身,又可影响病毒在鸡胚内的增殖。

  ②母源抗体 鸡感染病原或使用抗原后会使其种蛋带有母源抗体,从而影响病毒在鸡胚内的增殖。

  ③禽胚污染 禽胚污染是危害病毒增殖最严重的因素之一,应严格防止。定期清扫消毒孵化间,保持室内空气新鲜,无尘土飞扬。

  ①温度 通常禽胚发育的适宜温度为37~39.5℃,其适宜温度应控制在37.8~38℃。鸭、鹅孵化温度比鸡胚高。此外,鸡胚较能忍受低温,短期降温对鸡胚发育还有促进作用,故禽胚孵化温度应严格控制,宁低勿高。有些病毒对温度比较敏感,如鸡胚接种传染性支气管炎病毒后,应严格控制孵化温度,不应超过37℃。

  ②湿度 湿度可控制孵化过程中蛋内水分的蒸发。鸡胚孵化湿度标准为55%~65%

  ③通风 禽胚在发育过程中吸入氧气,排出二氧化碳。因此需更换孵化机内空气。

  ④翻蛋 在孵化过程中定期翻蛋,既可使胚胎受热均匀,有利于发育;又可防止胚胎与蛋壳粘连。翻蛋还可改变蛋内部压力,强制胚胎定期活动,促使胚胎发育。

  不同病毒的增殖有不同的接种途径,同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。如通常鸡胚发育至13~15日龄,鸭胚发育至15~16日龄,尿囊液含量最高,平均6~8ml,羊水1~2ml。因此,由尿囊腔接种病毒时,应根据不同病毒培养所需要的时间选择最恰当的接种胚龄,以获得最高量病毒液。

  可根据培养的病毒种类选择敏感细胞。选择的依据是病毒的适应性强、毒价高;细胞来源方便、制备简单、生命力强。

  生产毒种是由基础种子扩繁制备而成。通常将基础种子按规定在易感动物、禽胚或敏感细胞继代培养,经检验合格后,作为生产用毒种。毒种继代不超过3~5代。

  将合格的生产用毒种接种于细胞单层,病毒接种一般按维持液的1%~10%量接入。科学接种量应以TCID50为依据。病毒接种细胞方法有异步接毒和同步接毒两种。异步接毒是细胞长成单层后倒去生长液,将毒种37℃吸附1h后加入维持液。多数病毒采用该接毒方式。同步接毒是在制备细胞的同时或在制备细胞后4h内将病毒接入,主要用于病毒复制发生在细胞有丝分裂时期的病毒,如细小病毒等。

  接毒后选择适宜温度进行培养,大多数病毒增殖温度为37℃。病毒在敏感细胞内增殖一般会产生细胞病变(CPE),当CPE达75%左右时收获,反复冻融多次使病毒释放,细胞培养物;或将细胞培养物离心除去细胞碎片,收集上清液,即为半成品,-20℃保存。

  将合格的半成品加入保护剂或佐剂,制成活疫苗或灭活疫苗,入待检库。成品检验合格后,可以销售使用。

  细胞体外培养已成为增殖病毒的主要方法。细胞增殖病毒技术的原理主要是为病毒易感的组织细胞提供良好的体外生长环境,使细胞适应并繁殖,从而为病毒增殖提供宿主进行复制。

  (1)原代细胞 是指由新鲜组织经胰酶消化后,将细胞分散制备而成,如鸡胚成纤维细胞(CEF)。原代细胞对病毒的检测最为敏感,但制备和应用不方便。

  (2)次代细胞 原代细胞长成单层后用胰酶从玻璃瓶壁上消化下来后,再作培养的细胞称次代细胞,又称继代细胞。它保持原来细胞的理化特性不变,可在体外传代几代到几十代,最后不可避免地衰老死亡。次代细胞形态和染色体与原代细胞基本相同。

  (3)传代细胞 是指从原代细胞经传代培养后得来的可以长期连续传代的细胞。包括细胞株和细胞系。

  细胞系是指从原代细胞经传代培养后得来的一群不均一的细胞,可以长期连续传代。细胞系又分为有限细胞系和无限细胞系,有限细胞系在体外传代是有限的,无限细胞系能在体外无限传代,其染色体数目及增殖特性均类似于恶性肿瘤细胞,且多来源于癌细胞。

  细胞株由细胞系克隆获得的、具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群,其生物学性质、生化性质呈均一性。细胞株又分有限细胞株和连续细胞株。有限细胞株的大多数染色体为二倍体,能连续传很多代,但为有限生命;没有肿瘤原。广泛应用于病毒性生物制剂制备,安全可靠。连续细胞株可以连续传代,如HeLa细胞株。

  血清是细胞污染支原体、病毒等的重要来源。因此,对血清的质量控制尤为重要。血清必须无菌,不得有支原体污染,不得有牛黏膜病毒污染,血清中细菌内毒素含量应不高于10EU/ml

  首先选取适当组织或器官,采用机械分散法如剪碎、挤压等使之成为约1mm小块,然后用0.25%胰酶消化掉细胞间的组织蛋白,消化的时间长短与温度、组织的来源及大小等有关,一般37℃消化10~50min,4℃消化需要12h左右。消化好的组织块去掉胰酶经吹打成分散的细胞,加上营养液进行培养。

  多采用EDTA-胰酶消化法,胰酶浓度为0.05%,其作用是消化细胞间的组织蛋白;EDTA浓度为0.01%,其作用是螯合维持细胞间的钙镁离子和细胞与细胞瓶间的钙镁离子,使细胞易脱落和分散。

  细胞株与细胞系均需保存于液氮中(-196℃)。为保持细胞最大存活率,一般采用慢冻快融法。

  (1)静置培养 培养瓶和营养液都静止不动,细胞沉降后贴附在培养瓶内面上生长分裂,3~5d形成细胞单层。静置培养是最常用的细胞培养方法。

  (2)转瓶培养 将培养瓶放在转瓶机上,使营养液和培养瓶作相对运动,转瓶转速一般为9~11r/h,使贴壁细胞不始终浸于培养液中,有利于细胞呼吸和物质交换。可在少量的培养液中培养大量的细胞来增殖病毒,多用于生物制品生产。

  (3)悬浮培养 是通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法,培养瓶不动营养液运动。主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细胞,如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。

  (4)微载体培养 微载体是以细小的颗粒作为细胞载体,通过搅拌悬浮在培养液内,使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术,兼有单层和悬浮细胞培养的优点。

  (2)血清 血清中含有细胞生长的部分必需氨基酸,还有促进细胞生长和贴壁的成分。因此在细胞培养中必须加入一定量的血清方能获得成功。目前国内多用犊牛血清,使用前56℃水浴灭活30min。细胞培养时血清含量为营养液的10%,接毒后含量不超过5%。

  (3)细胞接种量 在适宜的培养条件下,需要有一定量活细胞才能生长繁殖,这是因为细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质,若细胞量太少,这些物质分泌量少,细胞生长为单层的速度也慢,但细胞过多对细胞生长也不利。

  (4)PH 细胞生长的PH值为6.6~7.8,但最适PH值为7.0~7.4。细胞代谢产生的各种酸性物质可使PH值下降,因此要使用缓冲能力强的培养液。

  (5)温度 细胞培养的最适温度应与细胞来源的动物体温一致,在此基础上,如升高2~3℃,则对细胞产生不良影响,甚至在24h内死亡。

  细胞培养污染以微生物的污染最常见,化学物污染较少,而细胞交叉污染近几年来随细胞种类的增多也有发生。

  (1)细菌污染 多见于消毒不彻底、操作不严格和环境污染所致,表现为营养液很快混浊和PH值下降,随之细胞死亡脱落。

  (2)真菌污染 也与消毒不彻底和操作不严格有关。在培养液中可见白色或黄色小点状悬浮物,镜检时可见菌丝结构。

  (3)支原体污染 支原体在细胞培养中最常见,不宜觉察,危害较大。目前细胞支原体污染率为50%~60%,主要来源于犊牛血清、实验人员、细胞原材料及已污染的细胞。目前多用以下方法:①抗生素处理 ②41℃18h ③加入特异性抗支原体高免血清等。这些方法在一定程度上能降低支原体在细胞培养中的滴度,但很难彻底清除。

  (4)病毒污染 病毒污染是指细胞培养中出现非目的病毒。其来源有组织带毒和培养液带毒。细胞一旦污染病毒,就很难排除。

  (5)胶原虫污染 在犊牛血清中,有时会发现一种新的对细胞培养有害的胶原虫,一经污染就难于消除。目前唯一的方法是将犊牛血清37℃培养1个月以上,然后高速离心取沉淀物镜检检查胶原虫。

  病毒须在敏感的宿主细胞中增殖,宿主细胞一般选择相应易感动物的组织细胞。通常病毒的细胞感染谱是通过试验获得的,同一病毒在不同敏感细胞增殖后其毒价不尽相同。

  细胞接种病毒后,在适宜温度下培养,多数病毒在敏感细胞内增殖可引起细胞代谢等方面的变化,发生形态改变,即细胞病变,显微镜下主要表现为:①细胞圆缩 ②细胞聚合

  ③细胞融合形成合胞体 ④轻微病变。 有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE,如猪瘟病毒和猪圆环病毒等。一般在CPE达75%左右时收获细胞培养物,低温冷冻保存。

  病毒在敏感细胞上增殖需要一定条件,只有在最佳条件下,病毒才能大量增殖,毒价才会最高。

  (1)血清 细胞培养必须加一定量血清以维持细胞的生长。但是,血清中存在一些非特异性抑制因子,它们对某些病毒的生长和增殖有抑制作用,经56℃30min不能被灭活。为了克服血清中非特异性抑制因子的作用,病毒维持液内血清含量一般不超过5%。目前已有无血清培养液可替代,以维持细胞活力并避免血清中某些物质对病毒增殖的抑制作用。

  (2)温度 病毒细胞培养的温度多数为37℃,此温度有利于病毒吸附和侵入细胞,如口蹄疫病毒于37℃可在3~5min内使90%的敏感细胞发生感染,而在25℃时需要20min,15℃以下则很少引起污染。但有些病毒的最适温度或高于37℃或低于37℃。

  (3)PH PH值一般在7.2~7.4才能防止细胞过早老化,有利于病毒增殖。如果维持液PH下降过快或过低,也可用7.5%NaHCO3液调整。

  (4)接毒量 接种量小,细胞不能完全发生感染,会影响毒价;接种量过大,会产生大量无感染性缺陷病毒,如水泡性口炎病毒。为获得培养液中典型病毒和高度感染性,接种时必须用高稀释度的病毒液,如应用高浓度的病毒液传代,在第3~4代时会出现明显的缺陷病毒,发生自扰现象,病毒滴度下降。

  (5)接毒方法 应根据病毒特点选择异步接毒和同步接毒,以获得高效价病毒。

  (6)支原体污染问题 支原体污染不仅消耗维持液的营养,从而影响细胞生长;同时,也可以影响病毒的增殖。

  治疗用生物制品是指用于治疗动物传染病的制品。一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原,经反复多次注射同一动物体,所产生的一类高效价抗体,主要包括免疫血清、卵黄抗体和牛奶抗体等。免疫血清又称高免血清或抗血清,根据免疫血清作用对象不同,可分为抗病血清和抗毒素两类。

  治疗用生物制品中都含有特异性的免疫球蛋白即抗体,输入动物体后,动物即可被动地获得抗体,从而形成免疫力,即所谓的人工被动免疫,因此可以在疫区对未发病动物进行紧急预防接种,一般不用于平时的预防接种。当动物已感染某种病原微生物发生传染病时,注射大量抗病血清后,血清中的抗体可抑制动物体内的病原体继续繁殖,并协助体内正常预防机能,消灭病原微生物,使病畜逐渐恢复健康。

  治疗用生物制品用作紧急预防注射,通常是在已经发生传染病或受到传染病威胁的情况下使用,其优点是注射后立即产生免疫,疫苗是起不到这种作用的。

  制备免疫血清的动物有马、牛、绵羊等。用同种动物生产的称同源血清,用异种动物生产的称异源血清。为了避免疫病的传播,制备抗血清时,一般要求用异种动物,通常用马和牛等大动物制备。生产中制备免疫血清用马较多,因为血清渗出率较高,外观颜色较好。由于动物存在个体免疫应答能力差异,所以选定动物应有一定的数量,一个批次应用多头动物。

  制造免疫血清的抗原,一般是用微生物或其毒素,或微生物的提取物等纯化的完全抗原。

  (1)细菌免疫原制备 基础免疫用抗原多为疫苗或死菌,而加强免疫的抗原,一般选用毒力较强的菌株。多价抗病血清用的抗原,要求用多血清型菌株。菌种接种于最适生长的培养基,按常规方法进行培养。通常活菌抗原需用新鲜培养菌液,并按规定的浓度使用,培养时间较死菌抗原稍短为好,多用16~18h培养物,经纯粹检查,证明无杂菌者,即可作为免疫抗原。为减少由培养基带来的非特异性成分,可通过离心,弃上清,再将菌体制成一定浓度的细菌悬液,作为免疫原。

  (2)病毒免疫原制备 以病毒为免疫原,须通过反复冻融或超声裂解方法,将病毒从细胞中释放出来,并尽可能地提高病毒滴度和免疫原性。如猪瘟血清,基础免疫的抗原,可用猪瘟兔化弱毒疫苗;加强免疫抗原,则用猪瘟血毒或脾淋毒乳剂等强毒。猪接种猪瘟强毒发病后5~7d,当出现体温升高及典型猪瘟症状时,由动脉放血,收集全部血清,经无菌检验合格后即可作为抗原使用。接种猪瘟强毒的猪,除血中含有病毒外,脾脏和淋巴结也有大量的病毒,可采集并制成乳剂,作为抗原使用。

  (3)抗毒素血清免疫原制备 免疫原可用类毒素、毒素或全培养物(活菌加毒素),但后两者只有需要加强免疫刺激的情况下才应用,一般多用类毒素作免疫原。

  免疫程序分为两个阶段,第一阶段为基础免疫,第二阶段为加强免疫。从被免疫动物初次接受免疫原刺激,到产生少量抗体,这段时间在制造程序中称为基础免疫。基础免疫对第二阶段的加强免疫有重要关系。

  (1)基础免疫 通常先用本病的疫苗按预防剂量作第1次免疫,经1~3周再用较大剂量的灭活苗或活菌或特制的灭活抗原再免疫1~3次,即完成基础免疫。基础免疫大多数1~3次即可,抗原无须过多过强,可为加强免疫产生有效地回忆应答打下基础。

  (2)加强免疫 亦称高度免疫。一般在基础免疫后2~4周开始进行。注射的抗原可采用灭活抗原,也可采用强毒微生物。微生物的毒力越强,一般免疫原性越好。免疫剂量逐渐增加,每次注射抗原间隔时间多为5~7d,加强的注射次数要视血清抗体效价而定。再用强毒微生物进行加强免疫时,必须在强毒动物舍或负压隔离器中进行,并采取严格的控制措施,以防散毒。

  (3)免疫途径 免疫原注射途径一般采用皮下或肌肉注射。如果免疫剂量大,应采用多部位注射法,尤其在应用油佐剂抗原时更应注意此点。

  (1)采集次数和方法 一般血清抗体的效价高峰在最后1次免疫后的7~10d。采血可以全放血或部分采血,即1次采集或多次采集,尽可能做到无菌操作。多次采血者,按体重每千克采血约10ml。全放血者,在最后1次高免之后的8~11d进行放血。放血前,动物应禁食24h,但需饮水以防止血脂过高。

  (2)血清的分离 采血时一般不加抗凝剂,全血在室温中自然凝固。待血液凝固后进行剥离或者将凝血切成若干小块,并使其与容器剥离。先置于37℃1~2h,然后置于4℃冰箱过夜,次日离心收集血清。如果采集的血量较大时,可采用自然凝固加压法。

  产蛋的禽类感染某些病原后,其血清和卵黄内均可产生相应的抗体,而且,卵黄中的抗体水平同样也随抗原的反复刺激而升高。因此,通过免疫注射产蛋鸡,即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体,与高免血清一样只限用于相应疫病的治疗和紧急预防接种。该类制剂称为卵黄抗体(IgY)。

  利用微生物、寄生虫及其代谢产物,或动物血液、组织制备的,专供诊断动物疫病、监测动物免疫状态及鉴定病原微生物的制品称为诊断制剂或诊断液。

  诊断抗原按性质分为颗粒性抗原、可溶性抗原两种,颗粒性抗原主要用于凝集性反应,可溶性抗原可用于沉淀性反应极其他种类的诊断试验。按照诊断试验的种类可将诊断抗原分为凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补体结合反应抗原、中和试验抗原及变态反应抗原等。

  一般选择符合要求的合格菌株,若型别不同,则根据需要选择使用。接种于适宜培养基培养。用含生理盐水洗下培养基上的细菌,经一定时间灭活,或用生理盐水洗下后加热灭活。将灭活的菌液过滤,除去大颗粒,离心弃上清,将沉淀用生理盐水或石炭酸生理盐水稀释成每毫升含规定菌数。经无菌检验、特异性检验和标化合格者即为浓菌液。间接凝集抗原制备使用的载体多为红细胞。先取可溶性抗原,然后将抗原按量吸附于双醛化的载体红细胞上,使红细胞致敏,即为间接凝集反应。

  目前应用的有布氏杆菌凝集反应抗原、马流产凝集反应抗原、猪萎缩性鼻炎凝集反应抗原、鸡白痢伤寒多价平板凝集试验抗原。

  根据使用方法不同,沉淀反应抗原可分为环状反应抗原、絮状反应抗原、琼脂扩散反应抗原和免疫电泳抗原等。

  (1)细菌沉淀抗原制备 选择适宜菌种接种于合适的培养基上培养。培养完毕后收集细菌培养物,灭菌、研磨成菌粉,按一定比例加入0.5%石炭酸生理盐水浸泡,过滤后的滤液即为沉淀抗原。也可将收集的细菌培养物直接加入一定量的或酒精,静置一定时间;或加入一定量醋酸,100℃水浴30min;或用裂解菌体等方法提取抗原,然后离心,收集上清,必要时浓缩即成为沉淀抗原。

  (2)病毒沉淀抗原制备 选用适宜的动物组织或细胞培养病毒。收获含毒高的动物组织制成匀浆,加入缓冲液或生理盐水,裂解细胞,置于40℃浸毒。高速离心取上清,灭活后即成沉淀抗原。

  鸡法氏囊病琼脂扩散反应抗原、马立克氏病琼脂扩散反应抗原、标准炭疽抗原、小鹅瘟病沉淀抗原、山羊痘沉

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